血浆lncRNA可作为非小细胞肺癌诊断的

摘要

近期研究表明长链非编码RNA（lncRNA）可以在诊断、预后等方面充当非侵入性的肿瘤标志物。本研究中，我们通过分析非小细胞肺癌患者体内循环的lncRNA的表达变化，以发现具有预知功能的潜在lncRNA。先前鉴定到的21个lncRNA被用于后续的lncRNA循环实验，处理组和对照组中候选的lncRNAs通过qRT-PCR进一步确认。处理组和对照组中循环的SPRY4-IT1、ANRIL和NEAT1在NSCLC患者血浆中显著上升。受试者诊断曲线分析（ROC）表明，ANRIL展示了最佳的诊断表现，ROC曲线值（AUC）达到了0.。此外，更进一步的分析表现了更高的潜力，AUC、灵敏度和特异性分别达到了0.、82.8%和92.3%。这三个指标的稳定性分析表明，循环的SPRY4-IT1、ANRIL和NEAT可以充当非小细胞肺癌早期诊断的标志物。

结果

处理组中NSCLC相关lncRNAs的筛选

我们首先检测了20个NSCLC患者和20个正常人血浆样本中21个候选的lncRNAs。如图1所示，包含SPRY4-IT1、CCAT2、RGMB-AS1、ANRIL、NEAT和PCAT1在内的6个lncRNAs在NSCLC患者血浆中显著上升，这与肿瘤组织中的相对表达水平是一致的。

图个候选的lncRNAs的相对表达

候选lncRNAs在cohortsI和II中验证

我们接下来分析了这些lncRNAs在一个包含50个病例和50个对照的样本中的表达变化。如图2所示，我们发现只有SPRY4-IT1、ANRIL和NEAT1与实验组的结果一致，而CCAT2、RGMB-AS1和PCAT1则没有显著差异。

图26种不同表达的lncRNA验证

我们更进一步分析了这些lncRNAs作为NSCLC潜在标志物的准确性和特异性。我们采用了50个病例和50个对照的一个独立实验，并命名为cohortII。这三个lncRNAs的异常表达在cohortII中得到证实（图3）。纵观这些检测和分析，这三个lncRNAs可以被选择并分析其预测能力。

图3SPRY4-IT1、ANRIL和NEAT1在NSCLC患者血浆中上调

风险评分被用来评估这三个lncRNAs的诊断意义。首先，我们根据高于对照组中95%置信区间的值来划分对照度和病例组，而风险评分的计算主要依据回归分析。然后，所有的血浆样本被划分为较高风险组，也就是潜在的NSCLC组，较低风险组则代表了对照组。我们将临界值定位为灵敏度+特异性的最大值。经计算，处理组中阳性预测值和阴性预测值分别为70%和80%。其次，我们运用同样的方法计算了验证组中相关数值，PPV和NPV分别为88%和81%（表1）。

表1非小细胞肺癌与正常对照血浆样品风险评分分析plasmasampls

受试者诊断分析曲线被用来评估这些lncRNAs在NSCLC中的预测能力。这些验证过的lncRNAs在ROC曲线下面区域的数值分别为0.、0.和0.。然而，这三个因素的综合分析则展示了相对适中的区分HCC患者和对照的能力，在ROC曲线下的数值为0.（图4）。

图4风险评分分析非小细胞肺癌三个潜在生物标志物的ROC

我们更进一步分析了这三个lncRNAs和已经确定的常用生物标志物（包括CA和CYFRA21-1）在NSCLC诊断中的相关性。皮尔斯相关性分析表明，这三个lncRNAs和CA以及CYFRA21-1均无相关性。此外，lncRNA的表达特性在NSCLC患者中的临床特性的相关性分析也做了计算。我们发现这三个lncRNAs和NSCLC的肿瘤大小高度相关，而不是组织学特性、肿瘤数量、病例级别或肿瘤分级（表2）。

表2SPRY4-IT1、ANRIL与NEAT1在NSCLC患者中的临床相关性

lncRNAs在人血浆中诊断稳定性

我们接下来对这三个lncRNAs在5个正常对照中进行扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。如图5所示，人血浆中均检测到这三个lncRNAs。更进一步，我们将从3个正常对照中获得的血浆样本在室温下孵育0、12、24h，并加以5个循环的冷冻-解冻处理和在80℃中保存7天。我们发现这三个lncRNAs中的任何一个的表达水平均未受到影响，这表明SPRY4-IT1、ANRIL和NEAT1可以稳定表达并在人血浆中被检测到。

图5lncRNA在血浆中的稳定表达，3个lncRNA的表达通过qRT-PCR检测

讨论

在本研究中，基于之前已报道的重要功能，21个lncRNAs被当作候选物。这些组织差异表达的lnRNAs可能体现了病人体液中一种交替水平。研究推测异常表达的循环lnRNAs可能源自肿瘤。因此，我们检测了病人以及健康对照中21种lncRNAs的表达。通过三个同年龄组多个阶段的检测，我们发现只有SPRY4-IT1,ANRIL以及NEAT1在NSCLC病人中表达增加。NSCLC病人肿瘤组织中上调的SPRY4-IT1被鉴定作为NSCLC不良预后的一个生物标志，该生物标志通过E-钙黏素和波形蛋白的表达促进肿瘤从上皮到间充质的转移。此外，ANRIL也同样被报道为NSCLC预后的一个潜在生物标志，同时ANRIL的异常调控可能在NSCLC的发生中发挥重要作用。另外，研究人员已经证明NEAT1可能在NSCLC中与肿瘤发生和发展相关，暗示其可应用于分子靶向治疗。

为了检测3个lncRNAs在NSCLC早期鉴定中的预测能力，我们也进行了一个风险得分分析来检测3个lncRNAs的预测能力。我们发现3个因子的联合表现出了0.AUC的高敏感性和高特异性，表明SPRY4-IT1，ANRIL以及NEAT1可能作为NSCLC预测的信号。已证明这3个lncRNAs与肿瘤大小相关联，可能暗示在NSCLC肿瘤发展中更大的肿瘤负担。

总而言之，我们鉴定了3个lncRNAs,SPRY4-IT1，ANRIL以及NEAT1，作为本研究中NSCLC肿瘤发生的潜在预测信号。这仅仅是我们工作的初步研究并且受到小样本的限制。这3个lncRNAs在调节NSCLC发病机理中更深层次的潜在功能是我们将来有必要探索的。

信息来源：

XiaodongHu1,JitaoBao,ZhnWang,tal.ThplasmalncRNAactingasfingrprintinnon-small-clllungcancr.TumorBiol.