小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞检测技术及应用

　　来源：临床检验杂志

　　目的：总结循环肿瘤细胞（CTC）检测的研究进展，及其在小细胞肺癌（SCLC）诊治方面的临床应用情况。方法：应用Medline、PubMed及CNKＩ期刊全文数据库检索系统，以“循环肿瘤细胞、小细胞肺癌和检测”为关键词，检索-年的相关文献。纳入标准：1）CTC检测与应用；2）肺癌CTC检测；3）SCLC患者CTC的临床应用。符合要求纳入分析的文献23篇。结果：CTC作为一种非侵入性的诊断原发肿瘤的“液体活检标本”，可实时、动态地对肺癌患者进行检测。目前CTC检测方法主要有流式细胞术、CTC芯片技术和细胞搜索系统及逆转录多聚酶链式反应，其中细胞搜索系统有较高的准确性和可重复性，但检查费用较高；CTC芯片技术敏感性极高，而只局限于筛选EpCAM阳性的CTC。CTC在SCLC人群中检出率为67%～86%，且外周血CTC含量与肿瘤的临床分期、转移复发有关。治疗过程中监测CTC数目的变化，可早期判断预后、评估治疗效果，CTC水平高的患者生存期明显短于CTC水平低的患者。但是，CTC检测在SCLC领域的应用价值仍需大样本前瞻性临床研究对各项研究结果进行验证。结论：肺癌CTC的检测及其临床应用尚缺乏统一的标准，诸多研究仍在进行。随着检测方法的不断改进，更多临床研究的支持，外周血CTC检测必将会在SCLC的诊断、治疗及预后方面广泛应用。

　　目前肺癌的发病率和死亡率已居世界首位，其中小细胞肺癌（smallcelllungcancer，SCLC）占10%～25%[1-2]。SCLC具有分化程度低、恶性程度高、生长迅速及易出现远处转移等特点，虽对放化疗比较敏感，但死亡率仍较高。肿瘤的复发或转移是导致患者死亡的主要原因，血液播散则是肺癌转移的重要途径。进入血循环的肿瘤细胞绝大多数通过免疫系统或通过血液动力学的力量很快被破坏，而极少的肿瘤细胞可随血液流动形成转移病灶[3]。循环肿瘤细胞（circulatingtumorcell，CTC）的数量代表发生血行转移的能力和程度，CTC检测在SCLC的早期诊断、监控复发转移、判断预后及评估抗肿瘤药物疗效等方面具有重要意义。

　　1、检测方法

　　CTC的检测方法可归纳为两类。一类是检测癌细胞表面特有的分子以区分癌细胞和血细胞，这些分子可以是上皮细胞特有血细胞没有的，也可以是癌细胞所特有的，通常基于抗原抗体反应的原理，包括流式细胞术（flowcytometry，FCM）、生物芯片（CTC-chip）技术和细胞搜索系统（CellSearchSystem）等。另一类是检测细胞表达的mRNA以区分肿瘤细胞和血液中的白细胞，可以是上皮细胞表达而白细胞不表达的，如细胞角蛋19（cytokeratin，CK19）等；也可以是肿瘤细胞特异性表达的，如癌胚抗原（carcinoembryonicantigen，CEA）、胃泌素释放肽原（Pro-gastrin-releasingpeptide，proGRP）等，此类方法主要为逆转录多聚酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainre-action，RT-PCR）。

　　1.1FCM

　　FCM是目前常用的细胞检测技术，该技术集激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学及单克隆抗体技术为一体。其优点是分析速度快而准确，可对靶细胞进行定量计数，还可以对细胞的物理化学特性做多参数分析。然而此技术检测靶细胞的敏感性较低（10-5），且需要的血液样本较多，限制了该技术的广泛应用[4]。随着技术不断改进，Takao等[5]报道了一种新型流式细胞仪用于肿瘤细胞的计数分析，被称为“iceap”，认为此技术在实体瘤的诊断及早期预测方面具有潜在应用价值。

　　1.2细胞搜索系统

　　细胞搜索检测系统是唯一通过美国食品和药物管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）批准用于临床的CTC检测技术，该系统集免疫磁珠富集技术和免疫荧光技术于一体。其原理主要是利用免疫磁珠技术将EpCAM标记的CTC从血液样本中富集分离出来，然后通过免疫荧光染色，将表型为EpCAM＋/CK＋/DAPI＋/CD45-细胞确定为CTC，再使用自动荧光显微镜进行计数。Bevilacqua等[6]首次通过细胞搜索系统检测SCLC患者外周血中的CTC，发现了Ep-CAM/CK阳性的CTC，但CTC对SCLC患者预后及检测的意义尚需通过随访大规模的队列研究进行验证。与其他检测技术相比较，细胞搜索系统具有敏感性高、可操作性强、高度自动化检测及数据精准等优点。近年来，应用此系统检测肺癌CTC的研究越来越多，但此检测方法成本较高且缺乏肿瘤特异性抗原，易出现误诊和漏诊，使其在临床上的广泛应用受到一定限制。

　　1.3生物芯片技术

　　CTC-chip技术是一种基于微流体学的CTC检测技术。检测灵敏度高且不影响细胞活性。每张芯片覆盖78，个包被EpCAM抗体的微位点，当血液样品通过微流芯片时，EpCAM阳性细胞结合到该位点上，被确认为CTC，可进行计数或分子生物学、遗传学分析[7-8]。Nagrath等[8]对68例上皮性肿瘤患者的份外周血进行CTC-chip检测，在其中的份血样中检测到CTC细胞，其敏感性、特异性分别达到99.1%与.0%，但这项技术的不足之处在于它只适用于EpCAM阳性细胞。第二代CTC-chip被称为Herringbone（HB）-chip，与第一代CTC-chip相比，在增加血液样本处理的同时，提高了捕获循环肿瘤细胞的能力。Stott等[9]对癌症患者血液样品进行检测，证实HB-chip在CTC-chip的基础上提高了26.3%的癌细胞捕获率，可捕捉血液样本中（95±0.6）%的癌细胞。

　　1.4RT-PCR

　　RT-PCR通过扩增特异性mRNA来检测组织或血液中存在的肿瘤细胞。由于血浆中含有大量的RNA酶，RNA一旦从细胞中分离出来，会立即被降解，因此外周血中检测到靶mRNA（肿瘤特异或组织特异表达而正常外周血细胞不表达的mRNA），可间接提示癌细胞的存在[10]。选择恰当的靶mRNA是决定检测结果是否可靠的重要因素。Saito等[11]采用巢式RT-PCR法检测肺癌患者外周血和胸腔积液中的SCLC细胞，preproGRPmRNA在SCLC患者高表达，而在非小细胞肺癌（NON-smallcelllungcancer，NSCLC）患者中不表达或低表达，在肺部良性疾病及健康人群中不表达，提示以preproGRPmRNA为靶基因的RT-PCR法是检测SCLC患者外周血癌细胞的敏感性及特异性较高的方法。Benedíková等[12]采用实时RT-PCR法，检测表皮生长因子的受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR1）、CEA、人类肺组织特异性Ｘ蛋白（lung-specificXprotein，LUNX）和肝细胞生长因子受体（hepatocytegrowthfactorreceptor，c-Met）在50例行根治性手术肺癌患者外周血、骨髓和肺循环血中的基因表达情况，确定了LUNX是用于检测肺癌最小系统性疾病（minimalsystemicdisease，MSD）；即循环或扩散的肿瘤细胞存在于患者身体中的间质隔室中，如淋巴结、血液或骨髓：敏感特异的标志。

　　2、临床应用

　　2.1临床诊断与分期

　　目前对肺癌的诊断和分期主要基于影像学或病理学检查的结果，难以精确反映肿瘤细胞血循环微转移对患者治疗及预后的影响，而CTC检测则可以弥补这一缺陷。血液系统是肿瘤转移的重要途径，是否发生远处转移是判断临床分期的标准之一。研究结果表明，CTC与肿瘤分期密切相关，对肺癌诊断具有潜在的应用价值[13-15]。Bevilacqua等[6]在1例肺组织活检诊断为低分化神经内分泌瘤的患者外周血中，检测到EpCAM和CK阳性的CTCs，然而EpCAM通常不表达于低分化神经内分泌瘤，其后进行肝穿刺活检发现肝内肺转移灶，最后确诊为SCLC。Tanaka等[13]利用细胞搜索系统，检测了例肺癌患者和25例非恶性肿瘤患者外周血的CTC，结果显示肺癌患者CTCs阳性率（30.6%）明显高于非恶性肿瘤患者的阳性率（12.0%），且肺癌患者CTCs计数显着高于非恶性肿瘤患者；而在肺癌患者中SCLC患者的CTCs阳性率高达66.7%，且CTC计数明显高于NSCLC患者；进一步分析发现，CTC计数随肺癌分期的增加而显着增加，Ⅳ期患者CTC计数显着高于Ⅰ～Ⅲ期患者，有远处转移的患者CTC计数显着高于无转移的患者。Hou等[15]检测了50例SCLC患者外周血中的CTCs，发现86%的患者检测到CTCs，且CTCs与肿瘤分期具有明显的相关性，ED期患者CTC数量明显高于LD期。CTC对肺癌的诊断价值尚处在摸索阶段，还需更多临床证据的支持，但CTC可作为肿瘤分期的有益补充，与影像学及病理学的检查结果结合，更准确地反映患者病情。

　　2.2转移与复发风险评估

　　转移和复发是肺癌患者死亡的主要原因，肿瘤的复发和转移主要通过淋巴及血液系统播散，虽然在外周血中检测到CTC并不意味着一定存在转移灶，但转移的概率会大大增加。肿瘤细胞通过循环系统种植于远处器官形成微转移灶，可能是肺癌发生远处器官转移的早期事件，若及时诊断肿瘤血循环微转移将有助于治疗方案的选择及预后的判断[16]。研究结果显示，CTC水平与肿瘤远处转移具有相关性[13-14]。Naito等[14]对51例SCLC患者研究发现，有0、1和≥2个器官转移的CTC基线水平中位数分别为2.0、7.5和21.0，肝转移患者的CTC计数（64）明显高于无肝转移（3）患者，P＝0.7；且CTC数目与发生转移的病灶数显着相关，ｒ＝0.72，P＜0.01。提示CTC有望作为肺癌转移的潜在筛选标志。Wu等[17]检测了47例肺癌患者的CTCs，结果显示复发患者CTCs阳性率（83%）比初治患者（78%）高，说明CTCs与肺癌复发有关。研究发现，SCLC患者外周血CTC检出率较高（67%～86%），且CTC计数明显高于NSCLC患者，这也验证了SCLC患者更易发生血行转移，因此在SCLC患者外周血中检测到CTC可早期预警疾病的转移复发，进而为选择合理的治疗方案提供依据，改善患者的预后[13-15]。

　　2.3疗效评价与预后判断

　　SCLC患者的治疗疗效与预后和多种因素有关。大量研究结果表明，CTC检测在预测肺癌化疗疗效及预后方面具有重要作用。目前化疗是SCLC首选的治疗方法，对治疗效果的判定主要是通过常规影像学检查来测量肿瘤病灶大小的变化，而对于微转移病灶影像学很难做出判断。一项小样本的临床随访研究发现，CTC数量与化疗后影像学应答存在相关性，提示CTC可实时监测肺癌患者的化疗疗效[17]。因此，治疗过程中动态监测CTC水平变化可从细胞水平对疾病治疗的药效监控和个体化治疗方案选择提供依据[18]。Hiltermann等[19]利用细胞搜索系统，发现59例SCLC中73%的患者CTCs阳性，其中每7.5mL血液中CTCs数目＞的患者中位生存期（d）明显低于CTCs数目＜2的患者中位生存期（d），化疗1个周期后大多数患者CTC含量下降，说明CTC可预测SCLC患者的化疗疗效与生存期。Hirose等[20]检测了33例转移性NSCLC患者外周血中的CTC，结果显示在36.4%的患者中检测到CTC，化疗响应率在CTC阳性患者和CTC阴性患者之间无差别，而化疗中CTC阳性患者的疾病进展率（66.7%）明显高于阴性患者（23.8%），P＝0.02；认为CTCs数目可作为预测转移性NSCLC化疗效果的有用指标。

　　有研究发现，对于接受化疗的97例SCLC患者，85%患者外周血存在CTCs，化疗前CTCs数目≥50和＜50的患者的中位无进展生存期（Progression-freesurvival，PFS）分别为4.6和8.8个月，中位总生存期（Over-allsurvival，OS）分别为5.4和11.5个月，1年生存率分别为4.9%和21.4%，证明基线CTCs数量是SCLC独立的预后因素；进一步分析化疗1个周期后CTCs数目的变化，发现CTCs数目不能降低到＜50的患者预后不良，中位OS仅为4.1个月[21]。Naito等[14]通过细胞搜索系统检测51例SCLC患者治疗前、治疗结束后3周及确诊复发2周后的外周血CTCs，发现治疗前CTC≥8与CTC＜8的SCLC患者的1年生存率分别为31.6%和78%，中位OS分别为8.5和17.2个月，P＝0.；治疗前后CTC均＜8的SCLC患者治疗后中位生存期＞18.8个月，而治疗后CTC≥8的患者仅4.1个月，差异有统计学意义，P＜0.05；37例复发患者中CTC≥8的患者中位复发后生存期（4.0个月）明显低于CTC＜8的患者（11.8个月），提示治疗前后CTC水平对SCLC患者预后预测有重要意义。国内研究结果也证实，CTC对肺癌患者生存期有较好的预测作用[22]。因此，CTC可作为判断肺癌患者预后的潜在预测因子，与传统的影像学检查相比，可更为早期、敏感地预测患者的OS，并且重复性较好[19，23]。由于CTC在SCLC预后方面的研究较少，上述结论尚需通过大规模、多中心的随访研究进行验证。

　　3、结语

　　CTC与肿瘤的复发转移有关，其检测有助于进一步了解肿瘤转移机制，为抗肿瘤转移的治疗提供新的依据。与淋巴结、骨髓相比，外周血标本易获得、创伤性小且可反复采集，是临床上常规检测较为理想的标本来源，被视为替代原发肿瘤的“液体活检标本”。但CTC检测的临床应用仍然存在许多问题，如缺乏特异性高的肿瘤标志，检测缺乏统一的标准，不能代替常规的影像学检查，且检测费用高昂。随着CTC检测方法的不断改进，敏感性和特异性逐渐提高，以CTC为基础的研究将会发展一批非侵袭性CTC试验，以期待为肺癌诊治提供常规检测手段和新的理论依据。

　　参考文献：（略）

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