ctDNA进化史分析描述早期肺癌的演变

肺癌是导致癌症死亡的主要原因，一旦发生转移基本就不能治愈，临床数据显示术后辅助化疗总生存只有5%是获益的。肿瘤负荷小和瘤内异质性低的似乎是对生存有益的。在乳腺癌和结肠癌中血浆ctDNA监测术后患者，对于那些高风险人群能预示复发。

非小细胞肺癌初次术后早期监测复发以及对新的亚克隆播散转移位点监测，可能为控制肿瘤复发提供新的治疗方式。早期肺癌用ctDNA这种非侵入性方法追踪肿瘤进化动态的能力目前还不确定。

这里作者使用了一个肿瘤特异性进化方法来描述前个招募到TRACERx试验（clinicaltrials登记：对I~IIIA期NSCLC患者术后动态检测，观察随时间变化后出现原发灶、转移灶及瘤内异质性的演变）的研究对象的ctDNA，其中包括了一个病人招募在PEACE（死后评估晚期癌症环境）事后研究。

ctDNA进化图谱

TRACERx研究监测的是NSCLC患者从诊断到死亡的克隆演化，fig1是研究的概况，通过前瞻性分析前个入组患者，采用多区域（R1~R4）外显子测序建立进化树，对早期NSCLC的ctDNA谱统计分析进化树。对于每个患者综合使用给定的多重PCR分析板，血浆中选择靶向克隆与亚克隆SNVs追踪进化树的分支。

分析确认了多重PCRNGS平台在SNVs频率超过0.1%时候敏感性达到99%以上，特异性99.6%，敏感性定义在2个SNVs阈值。

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NSCLC中ctDNA检测的决定因素

为了确定在入组的患者中哪些病人更能在外周血中检测到ctDNA，故对个患者进行分析，排除4个（1个没有术前外周血标记、2个全外显子测序数据质控失败、1个多重PCR平台分析失败），最后96个患者对分期、坏死、PET、Ki67%、淋巴结侵犯、淋巴管侵犯、肿瘤大小与ctDNA关系分析（fig2a）。

Fig2a可见48%的患者（46/96）在早期NSCLC外周血ctDNA中检测到至少2个SNVs，有12个患者检测到至少1个SNVs，而在检测到的SNVs中97%的患者（30/31）是肺鳞癌，71%（5/7）是其他类型，而肺腺癌只有19%（11/58），I期鳞癌中ctDNA检测出94%的患者（16/17），而相对I期腺癌只有13%（5/39）（下图a）。

ctDNA与肿瘤坏死也有关，这也与既往的研究相符合，即ctDNA部分是由于坏死后释放到外周血中，而这也与鳞癌的生物特性坏死较多相符合。肿瘤活性越高（PET）、增殖约活跃（Ki67%）、高危（淋巴结侵犯、淋巴管侵犯），ctDNA释放到外周血更多（下图c）。

可见ctDNA的更能反应相对恶性度高、活性高的鳞癌。

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ctDNA阳性的患者进行克隆和亚克隆SNVs分析

46个ctDNA阳性的患者克隆SNVs都能检测出，而在用靶向分析panels中能检测出克隆平均值为94%（11-%）。亚克隆分析中用靶向panels能检测出值为87%（40/46），但是用NGS只能检测到68%患者（27/40），可见分析亚克隆选用靶向panels更合适（fig2b），而对于克隆分析SNVs中的平均血浆变异等位基因频率（VAF）更加合适（下图a）。

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肿瘤体积预测VAF

肿瘤体积与血浆克隆VAF相关，并且鳞癌相关性更好（fig3a）。预测克隆时肿瘤体积在10cm3时候VAF为0.1%（fig3b），预测亚克隆时，先定义亚克隆为平均癌症细胞分数（CCF），是肿瘤体积乘以纯度。CCF与血浆中SNV检测阳性相关（fig3c：1.70cm3VS4.06cm3），而CCF还与亚克隆VAF相关（fig3d）

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术后ctDNA检测预测NSCLC复发

SNVs的检测早于临床上CT发现的肺癌复发（fig4a~g），平均早70d，甚至有些能在1年前就预示着肿瘤复发。对于术前有检测到VAF的，术后检测不到或下降，而术后有检测到的在一年内都复发了（fig4a-b），对于术后一直没有复发的患者血中ctDNA一直是阴性的（fig4h）。fig4b术后化疗后在第天查血ctDNA和胸部CT示怀疑有病灶，而且ctDNA也是高的，在天证实复发，可见ctDNA能反应化疗的耐药。对于fig4e术前颅内评估无转移，但是术后ctDNA一直存在，在术后54天确实诊断为颅内转移，可见ctNDA反应了潜在转移灶。对于进化树，术前和术后复发基本相似，但是在亚克隆分支上还有存在一点区别，可能正是这些新的亚克隆的出现使得肿瘤复发。

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确认进化特征

从复发的转移组织结合原发肿瘤M-seq来确认亚克隆ctDNA。

Fig5a是个IIa期术后椎旁复发，对原发肿瘤和转移肿瘤进行外显子分析，转移肿瘤的ARID1A并没有在原发肿瘤中检测到，在原发组织包含的OR5D18可能是导致转移的亚克隆。对术前血和术后血靶向测序，发现术后SNV同样多了ARID1A，而术前血包含有OR5D18。这些数据表明，ctDNA可以反应在原发性肿瘤区域中潜在存在的转移亚克隆驱动群。Fig5b/c/d可见ctDNA能反应术后多发转移的情况。对于fig5e是个淋巴结转移，术后化疗后ctDNA检测不到。

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转移位点ctDNA谱

对CRUK这个患者进行分析，该患者从诊断到死亡完成的病程。在治疗过程中取了椎旁的，死后尸检了6个转移灶。从图中可见，转移灶和原发灶由相同的ctDNA，但每个转移灶又有自己独特的ctDNA。

总结：

作者在早期非小细胞肺癌中用ctDNA能预测非腺癌、坏死、高增殖、淋巴结侵犯，在三阴性乳腺癌中也有类似情况，表明ctDNA的应用性强。ctDNA血浆VAF为0.1%时候，能预测原发肿瘤在10cm3大小。VAF为0.1%以上时候采用多重PCR的NGS平台的敏感性超过99%。采用靶向测序panels能描述出肿瘤原发灶和转移灶的克隆和亚克隆，及化疗耐药情况。这些发现表明，由ctDNA平台指导的药物开发以减少残留疾病，确定辅助治疗反应，并在NSCLC临床复发前靶向出现亚克隆。

文献







































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