小细胞肺癌岩藻糖化蛋白标志物研究

糖基化蛋白质组学技术是常用的血浆样品研究方法。一方面，大量疾病标志物蛋白都含有糖基化，如Her2/neu、PSA、CA分别作为乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌的标志物。而一些高丰度蛋白，如白蛋白等，不含有糖基化修饰。因此通过对血浆中糖基化蛋白的富集，可以简化血浆体系，减小高丰度蛋白的影响；另一方面，蛋白的糖基化结构本身就是标志物的一种，是挖掘标志物的重要对象。如恶性肿瘤糖链常出现高甘露糖型比例增加、核心岩藻糖增多、平分型GlcNAc增加、天线数增多、重复N-乙酰氨基乳糖序列的增减、末端唾液酸过表达等。年美国FDA批准的肝癌标志物AFP实际的检测目标，是AFP-L3在全部AFP中的百分含量。AFP-L3是含核心岩藻糖修饰的AFP类型。在简化体系的策略中，一般采用阱化学法，而针对特殊糖型的蛋白质组学研究则通过使用凝集素进行。

凝集素是一类能非公价吸附糖链的蛋白质，不同类型的凝集素可特异结合某类糖结构。如伴刀豆凝集素（ConcanavalinA，ConA）对甘露糖有特异的亲合作用、麦胚凝集素（WheatGermAgglutinin，WGA）对N-乙酰氨基葡萄糖有特异的亲合作用等。因此，凝集素可以作为一种探针来研究蛋白特定的糖基。

Ahn等人使用凝集素AAL(AleuriaAurantiaLectin)针对性地富集血浆样品中岩藻糖化蛋白，对小细胞肺癌进行了研究。(IntegratedGlycoproteomicsDemonstratesFucosylatedSerumParaoxonase1AlterationsinSmallCellLungCancer.MolCellProteomics.;13(1):30-48)除作为对照的健康组(Healthycontrol,HE)血浆样品外，研究人员还采集了小细胞肺癌的局限期(LimitedDiseasestage,LD)和广泛期(ExtensiveDiseasestage,ED)组血浆样品，每组29个。样品采集30分钟内，4℃，g离心10分钟。取离心后血浆上清微升移入cryotubes中，-80℃保存。

实验中，1)首先使用亲和柱去除LD、ED和HE的血浆中的白蛋白与IgG；2)使用凝集素AAL富集样品中含有的岩藻糖的糖基化蛋白质；3)使用蛋白酶，将富集组分酶解成为多肽；4)为各组分标记不同的稳定同位素质量标签，之后将三组样品混合；5)根据肽段等电点的差异，通过无胶电泳，将样品分为12个组分；6)采集个组分的液质数据，使用软件鉴定并定量差异蛋白；7)使用MRM和凝集素ELISA混合分析法，验证发现的的岩藻糖化差异蛋白。

在对发现的候选标志物进行验证的过程中，除了使用质谱法外，Ahn等人还使用了HLE法(HybridAALELISA，凝集素AAL与ELISA联用法)。方法中是在96孔板中固化候选蛋白抗体，当检测血浆加入反应孔后，的候选蛋白将被其特异性抗体吸附。然后加入生物素化凝集素试剂。此试剂的凝集素部分将与岩藻糖结构吸附，而试剂的生物素部分将与后续加入的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素结合。最终，加入TMB试剂，其被辣根过氧化物酶催化后被扫描检测，从而完成对岩藻糖化候选蛋白的定量验证。

在此研究中，使用稳定同位素标记定量法，通过与健康样品对比，在小细胞型肺癌的局限期(LD)和广泛期(ED)血浆中，分别发现了10个和31个岩藻糖化表达上调蛋白，以及33和14个下调蛋白。通过进一步实验筛选出了四个岩藻糖化蛋白，被认为是潜在的小细胞型肺癌标志物，分别是SerumAmyloidPComponent(APCS)、ComplementComponent9(C9)、SerumParaoxonase1(PON1)和Kallistatin(SERPINA4)。四个蛋白中，APCS和C9的全蛋白表达水平和岩藻糖化水平，在局限期(LD)和广泛期(ED)都发生了上调。SERPINA4的全蛋白表达量并未有显著，但其岩藻糖化水平下调。而PON1(serumparaoxonase1)的全蛋白水平发生了下调，但岩藻糖化水平发生了上调(如下图)。APCS是穿透素家族中的一员，在先天免疫和炎症反应中有重要作用。C9蛋白是膜攻击蛋白复合物的一个成孔亚基，在先天免疫反应对靶细胞穿孔起关键的作用；PON1可与高密度脂蛋白（HDL）结合，消除有机磷化合物，如对氧磷，及由脂质过氧化产生的致癌的脂溶性分子；SERPINA4是丝氨酸蛋白酶抑制剂，并可与肝素结合，其已被发现可抑制路易斯肺癌小鼠模型的血管生成和炎症活动。

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